HPLC概述

高效液相色譜法(HPLC)是上個世紀(jì)七十年代迅速發(fā)展起來的一項高效、快速的分析分離技術(shù)，是現(xiàn)代分離測試的重要手段。

色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相(station phase)發(fā)生作用(吸附、分配、排阻、親和)的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。

HPLC是在經(jīng)典的液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其以液體作為流動相，并采用顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。其分離機制與常規(guī)柱色譜相同，但填料更加精細(xì)，需高壓泵推動，柱效高，分析速度快。

與氣相色譜不同的是液相色譜中流動相亦參與組分的分離過程，其組成、比例和pH值可靈活調(diào)節(jié)，分離模式多樣。在實際操作中主要通過改變流動相的組成來調(diào)節(jié)樣品在色譜柱的保留值和選擇性，從而使不同樣品得到分離。

高效液相色譜法的應(yīng)用范圍十分廣泛，對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，幾乎所有的化合物包括高沸點、極性、離子型化合物和大分子物質(zhì)均可用高效液相色譜法分析測定，因而彌補了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機化合物中，可用氣相色譜分析的約占20% ，而80% 則需用高效液相色譜來分析。

高效液相色譜儀在生物制藥中的應(yīng)用

高效液相色譜儀是近幾十年發(fā)展起來的一種高效、快速的分離分析技術(shù)，是現(xiàn)代分離檢測的重要工具。高效液相色譜儀是以經(jīng)典液相色譜儀為基礎(chǔ)，引入氣相色譜儀的理論和實驗方法，將流動相改為高壓輸送，采用高效固定相和在線檢測等手段，發(fā)展而成的分離分析技術(shù)，具有高壓、高速、高效、高靈敏度、高選擇性和應(yīng)用范圍廣等特點，成為生物制藥領(lǐng)域發(fā)展快、應(yīng)用廣的現(xiàn)代分析技術(shù)之一。

二、高效液相色譜儀在檢測藥含量方面的應(yīng)用：

藥與人類的健康、生活質(zhì)量的提高關(guān)系極大，許多藥品由于受到純度的影響，效果不能充分發(fā)揮，甚至產(chǎn)生毒副作用；有時服用前需作各種試驗，帶來很多麻煩，高效液相色譜儀的檢測就比較簡單，是分離與純化藥的較佳選擇。由于高效液相色譜儀具有靈敏度高、快速簡便和專一性的特點，廣泛應(yīng)用于藥分析，特別在干擾較多的時候表現(xiàn)得比其它方法好。

三、高效液相色譜儀在檢測制藥廢水中的應(yīng)用：

制藥廢水中的殘留藥成分對環(huán)境造成的污染越來越嚴(yán)重, 制藥廢水的治理已成為環(huán)境保護(hù)工作中相當(dāng)重要的方面。

高效液相色譜法實驗結(jié)果分析

現(xiàn)代色譜分析法是有效而快速的分離、分析手段，既可用于定性分析，又可用于定量分析。高效液相色譜法與氣相色譜法的定性分析和定量分析方法（包括測定方式和計算方法）相同。在定性分析中，有用純物質(zhì)對照的色譜鑒定法，還有收集餾分與化學(xué)方法或其他儀器分析方法聯(lián)用的非色譜鑒定法；在定量分析中，可以用峰高或峰面積以內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法或歸一化法定量，并與微機聯(lián)用作為現(xiàn)代化的分析工具。

定性分析

色譜分析法定性分析的目的就是確定每個色譜峰代表什么組分，從而確定由這些組分所構(gòu)成的混合物試樣的組成。常用的主要定性方法有色譜鑒定法和非色譜鑒定法兩種。

1．色譜鑒定法定性

色譜鑒定法就是用純物質(zhì)對照定性，這是氣相和高效液相色譜法中常用的方便的一種定性方法，可以和定量測定操作同時進(jìn)行。

(1)利用保留值定性

在色譜條件一定的情況下（包括柱長、柱內(nèi)徑、固定相、柱溫、流動相及流速等），每一種物質(zhì)都有其一定的保留值（包括保留時間、保留體積、調(diào)整保留時間、調(diào)整保留體積等），一般不受其他組分的影響，可以作為定性的根據(jù)。此法又稱為純物質(zhì)對照定性。

在相同的色譜條件下，先測定未知物中每個色譜峰的保留時間或保留距離，再將要測的某純物質(zhì)注入色譜儀，對照比較兩者的保留值，如果兩者的保留值相同，就可判定該未知物與已知純物質(zhì)是同一種物質(zhì)。

(2)利用加入純物質(zhì)增加峰高法定性

在穩(wěn)定的色譜條件下，為了區(qū)分兩個保留值（保留時間或保留距離）非常接近的組分，可以將某純物質(zhì)直接加入到試樣中，再注入色譜儀，如果某組分峰的峰高增加了，表明這個色譜峰就是加入的純物質(zhì)。此法又稱為純物質(zhì)追加法定性。

色譜鑒定法定性需要有純物質(zhì)對照，在沒有純物質(zhì)時，可以用非色譜鑒定法定性。

高效液相色譜儀操作進(jìn)樣閥的問題

1、進(jìn)樣量的控制。

用進(jìn)樣閥來進(jìn)樣時，閥內(nèi)的樣品環(huán)是定量的，(一般分析型進(jìn)樣閥的樣品環(huán)體積為20ul)，由于進(jìn)樣時，注射到進(jìn)樣閥內(nèi)的樣品溶液在樣品環(huán)的管路中有徑向的速度梯度(即管軸處比管壁處的液流速度快)。因此，要想使樣品環(huán)中充滿樣品溶液，從而使用進(jìn)樣閥來準(zhǔn)確地定量，則必須使進(jìn)樣量大于樣品環(huán)體積的2倍。

2、進(jìn)樣閥的清潔問題。

如果樣品環(huán)中有上次進(jìn)樣時樣品的殘留，必然會污染下次注射進(jìn)的樣品，為防止這種現(xiàn)象的發(fā)生，應(yīng)按步驟操作。

3、進(jìn)樣閥溢流管的堵塞。

有時，進(jìn)樣閥的溢流管會發(fā)生堵塞現(xiàn)象，向進(jìn)樣閥內(nèi)注射樣品時，注射針推不動。此故障是由于溢流管的堵塞所致。堵塞的原因多半是由于溶解樣品的流動相用的是鹽溶液，而其中的鹽在溢流管的排空端口處結(jié)晶所致。此時，可用小燒杯盛少量蒸餾水對溢流管口稍加浸泡，端口處鹽的結(jié)晶就能被溶解掉，故障排除。如能在每次進(jìn)樣完成之后，用蒸餾水反復(fù)沖洗至溢流管中的鹽分全部沖出，則可避免此故障的發(fā)生。