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博日養(yǎng)殖場核酸提取純化歡迎來電

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發(fā)布時間:2020-10-17 18:34  






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PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板,從而進入平臺期。研究表明熱工過程可以殺滅病毒(如流行性腹瀉病毒),但這只能作為緊急緩解措施,因為這要求產(chǎn)品在干燥和運輸過程中必須不存在交叉污染。在傳統(tǒng)的PCR中,常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應(yīng)的終擴增產(chǎn)物,因此用此終點法對PCR產(chǎn)物定量存在不可靠之處。在real-time Q-PCR中,對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行了實時的監(jiān)測和連續(xù)地分析擴增相關(guān)的熒光信號,隨著反應(yīng)時間的進行,監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。

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在PCR反應(yīng)早期,產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別,而后熒光的產(chǎn)生進入指數(shù)期、線性期和終的平臺期,因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點上來檢測PCR產(chǎn)物的量,并且由此來推斷模板i初的含量。②操作簡單、用時短,整個提取流程只有四步,大多可以在36-40分鐘內(nèi)完成。為了便于對所檢測樣本進行比較,在real-time Q-PCR反應(yīng)的指數(shù)期,首先需設(shè)定一定熒光信號的域值,一般這個域值(threshold)是以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號(baseline),熒光域值的缺省設(shè)置是3~15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。


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相對常規(guī)PCR而言,熒光定量PCR的主要優(yōu)點是準確地確定初始模板拷貝數(shù)和寬的動態(tài)范圍內(nèi)和高的靈敏度。熒光定量PCR結(jié)果可以用于定性(判斷一段序列的有無),也可以用于定量(確定DNA拷貝數(shù)),即qPCR,而常規(guī)PCR只能做半定量。還有,由于PCR反應(yīng)和檢測都在反應(yīng)管中進行,樣品污染的幾率大大降低,無需擴增后的實驗操作。另外,熒光定量PCR的結(jié)果無需通過瓊脂糖凝膠電泳來評估,大大節(jié)省實驗時間,提高實驗效率。還有,由于PCR反應(yīng)和檢測都在反應(yīng)管中進行,樣品污染的幾率大大降低,無需擴增后的實驗操作。

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簡單的講PCR技術(shù)早是用于擴增一段特異的PCR片段,用于克i隆、測序等實驗,后來也將其用于樣本中特異的PCR片段有無或相對定量,而熒光定量PCR技術(shù)則是為了測定樣本中特異的PCR片段相對或絕i對量,是一種測定特異的PCR片段含量的方式。此外,用real-timeQ-PCR來研究mRNA時,受到不同RNA樣本存在不同的逆轉(zhuǎn)錄(RT)效率的限制。如測定病i人樣本中病原體的含量、實驗樣本中某一特定的mRNA的含量等。有人講過普通PCR后,通過電泳也可以進行定量,其實是將PCR產(chǎn)物的定量與PCR樣本中模板定量相混了。


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相對定量可以對每個樣本中模版的其實水平之間的差異進行精i確比較,沒必要知道模版的確切拷貝數(shù),并且樣本模板中的相對水平不用使用標準曲線就可以確定。96孔板比較方便,加完樣品后只需附上一層膜,用它自帶的板子撫平即可。相對定量分析以實時PCR方式執(zhí)行,在實時PCR分析過程中,PCR基因擴增一直在監(jiān)控中,在PCR進行期間進行數(shù)據(jù)采集,而不是在PCR結(jié)束時(終點PCR)才獲取數(shù)據(jù)。在實時PCR中,反應(yīng)是在目標的擴增早被監(jiān)測到時用循環(huán)中的時間點來描述的,而不是在PCR結(jié)束時通過目標的累計數(shù)來描述。

在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。有人講過普通PCR后,通過電泳也可以進行定量,其實是將PCR產(chǎn)物的定量與PCR樣本中模板定量相混了。SYBR僅與雙鏈DNA進行結(jié)合,因此可以通過溶解曲線,確定PCR反應(yīng)是否特異。


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