液相色譜的分離過程

同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。

開始樣品加在柱頭上，假設(shè)樣品中含有3個(gè)組分，A、B和C，隨流動相一起進(jìn)入色譜柱，開始在固定相和流動相之間進(jìn)行分配。分配系數(shù)小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分C在固定相上滯留時(shí)間長，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數(shù)介于A，C之間，第二個(gè)流出色譜柱。若一個(gè)含有多個(gè)組分的混合物進(jìn)入系統(tǒng)，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達(dá)到分離之目的。

不同組分在色譜過程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學(xué)平衡問題，也是分離的首要條件。

其次，當(dāng)不同組分在色譜柱中運(yùn)動時(shí)，譜帶隨柱長展寬，分離情況與兩相之間的擴(kuò)散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關(guān)。所以分離效果則是熱力學(xué)與動力學(xué)兩方面的綜合效益。

液相色譜特點(diǎn)

①高壓：流動相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。

②高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。

③高：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達(dá)到分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。

④高靈敏度：紫外檢測器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在μL數(shù)量級。

⑤應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。

⑥柱子可反復(fù)使用：用一根柱子可分離不同化合物

⑦樣品量少、容易回收：樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。此外液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與氣相色譜相比各有所長，相互補(bǔ)充。液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

制備液相色譜特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)

高壓—壓力可達(dá)150~300Kg/cm2。色譜柱每米降的壓為75 Kg/cm2以上。

高速—流速為0.1~10.0 ml/min。

高效—可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。

高靈敏度—紫外檢測器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。

HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：

速度快—通常分析一個(gè)樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。

分辨率高—可選擇固定相和流動相以達(dá)到較好分離效果。

靈敏度高—紫外檢測器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)0.1pg。

柱子可反復(fù)使用—用一根色譜柱可分離不同的化合物。

樣品量少，容易回收—樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。